ADN et ADNe

Équipement et matériel

ÉCHANTILLONNAGE SUR LE TERRAIN FILTRATION CONSERVATION DES FILTRES
Bouteilles d’échantillonnage Nalgene de 1 L en polypropylène (PP) ou en polyéthylène haute densité (PEHD) Entonnoirs de filtration de 250 mL d’un diamètre de 47 mm et membrane de nitrate de cellulose avec des pores d’une dimension de 0,45 µm Enveloppes en papier pour pièces de monnaie (3 x 5 ” ou 7,5 x 12,5 cm) et déshydratant en grains de silice ou flacons pour travaux cryogéniques de 2 mL avec un joint torique et de l’éthanol de qualité moléculaire de 95 – 100 %
Marqueur permanent Pompe à vide de grande capacité (p. ex. Gast, avec 1,1 PCM, 65 cm de haut, 115 VCA) Sac à fermeture par pression et glissière (de type Ziplock)
Gants jetables non poudrés (nitrile ou latex) Tubes de silicone de la bonne grosseur pour connecter le flacon de la pompe à la pompe elle-même Marqueur permanent
Bac avec une solution d’eau de Javel à 10 % Flacon de 1 L pour la pompe  
Brosse à récurage Bouchon de caoutchouc n° 8  
Carnet Deux paires de pinces à dissection droites ou de pinces à épiler en acier inoxydable  
GPS Solution d’eau de Javel à 50 %  
Glacière avec de la glace ou des blocs réfrigérants réutilisables Eau distillée ou désionisée  
Facultatif : perche télescopique de 35 cm avec un panier à bouteilles attaché (du type utilisé sur les vélos) Trois récipients de rinçage pour nettoyer les pinces  
  Tasse graduée de 1 L  

Pour nous envoyer des suggestions sur l’équipement et le matériel, contactez-nous au 1.877.706.7678 ou au 519.836.2400, poste 7067714.

Procédure d’échantillonnage

  1. Mettre une étiquette sur tous les contenants d’échantillonnage et, à l’aide d’un marqueur permanent, y inscrire tous les renseignements pertinents (c.-à-d. le numéro d’identification du site, de l’échantillon, etc.). Il est important de se souvenir que plus d’un contenant d’échantillonnage pourrait être requis selon le plan d’échantillonnage en place.
  2. Mettre une nouvelle paire de gants à chaque site d’échantillonnage et éviter tout contact entre les gants et autre chose que les contenants.
  3. Rincer tous les contenants d’échantillonnage et les bouchons trois fois avec de l’eau de surface qui se trouve près du point d’échantillonnage. Refermer le bouchon fermement et agiter le contenant. Jeter immédiatement l’eau loin du point d’échantillonnage (en aval, sur la berge ou sur la terre).
  4. Remplir les contenants d’échantillonnage avec 1 L d’eau de surface du site d’échantillonnage et bien resserrer le bouchon. Déposer immédiatement les contenants pleins dans la glacière, sur la glace.

Procédure de filtration

  1. Faire passer le tuyau de la pompe au flacon, attacher le bouchon de caoutchouc au flacon et brancher la pompe dans la source d’énergie.
  2. Insérer l’adaptateur en plastique de l’entonnoir dans le bouchon de caoutchouc pour que le sceau soit étanche à l’air. Retirer le filtre de son emballage et l’attacher à l’adaptateur de l’entonnoir. On doit se montrer prudent de ne pas toucher l’intérieur de l’entonnoir pour éviter de le contaminer.
  3. Retourner doucement le contenant plusieurs fois pour mélanger l’échantillon qu’il contient. Verser ensuite délicatement l’échantillon dans l’entonnoir contenant le filtre jusqu’à ce qu’il soit plein. Prendre note du volume versé dans l’entonnoir et de l’heure de début de la filtration, qui commence lorsque la pompe est mise en marche.
  4. Ajouter le reste de l’échantillon d’eau progressivement à mesure que la pompe filtre l’eau pour éviter d’avoir à jeter le surplus causé par un colmatage du filtre ou un débit trop lent ou qui s’arrête complètement.
  5. Lorsque l’échantillon est filtré au complet, utiliser la tasse graduée pour mesurer le volume de l’échantillon d’eau qui est passé à travers la membrane jusque dans le flacon de la pompe et le noter avec la durée complète de la filtration.

Procédure de conservation

  1. Utiliser une enveloppe pour la monnaie (pour une conservation au sec dans la silice) ou un flacon de 2 mL pré-rempli d’éthanol (pour une conservation dans l’éthanol) et, à l’aide d’un marqueur permanent, y inscrire les renseignements pertinents sur l’échantillon (comme le numéro d’identification du site, de l’échantillon, etc.).
  2. Avant de retirer les filtres (les échantillons) de l’entonnoir, nettoyer les deux paires de pinces dans un premier verre contenant une solution d’eau de Javel à 50 % pendant au moins une minute et les brasser dans le deuxième verre contenant de l’eau distillée ou désionisée. Ensuite, déposer les pinces dans le troisième verre contenant de l’eau distillée ou désionisée pendant au moins 30 secondes. Ces étapes permettent d’éviter la contamination et les dommages à l’ADNe provoqués par les résidus de Javel. Il est en effet primordial d’en retirer toutes les traces.
  3. Pour la conservation des échantillons dans la silice, on doit veiller à ce que la membrane soit sèche. Pour ce faire, attendre que toute l’eau soit passée et envoyer de l’air dans le filtre de trois à cinq minutes avec la pompe à vide. Pour la préservation dans l’éthanol, il n’y a pas besoin de sécher la membrane.
  4. Briser doucement le sceau entre le filtre et l’adaptateur de l’entonnoir. Pour ce faire, tirer sur l’entonnoir vers le haut : ne pas apposer de torsion pour éviter d’endommager la membrane de l’échantillon et perdre de ce dernier.
  5. Utiliser les pinces propres pour plier, doucement, la membrane sur elle-même une seule fois (pour la conservation dans la silice) ou deux fois (pour la conservation dans l’éthanol) avec le filtrand à l’intérieur.
  6. Déposer le filtre plié dans l’enveloppe ou dans un flacon avec de l’éthanol. Placer l’enveloppe dans un sac à fermeture par pression et glissière (de type Ziplock) avec des grains de silice et sceller le sac. Placer le flacon avec de l’éthanol dans un sac du même type et le sceller. Écrire les renseignements pertinents sur tous les sacs. Pour prévenir la contamination, séparer les enveloppes par site dans des sacs différents.

Références

Jared Hobbs et Caren Goldberg, Environmental DNA Protocol for Freshwater Aquatic Ecosystems, version 2.2, ministère de l’Environnement de la C.-B., Direction des écosystèmes de Victoria, C.-B., novembre 2017.

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